羊水细胞培养染色体检查

基本信息

专科分类： 孕产检查
检查分类： 基因检测（DNA）
适用性别： 女性
是否空腹： 　空腹
手术参考价： 150元
科　室： 孕产检查

羊水细胞培养染色体检查检查简介

由于有害化学物质、X线照射、环境因素影响，高龄妊娠，近亲配婚等，导致妊娠时染色体的数目、形态、结构及结合上发生变异所引起的疾病。羊水细胞的染色体检查，对染色体疾病的产前诊断具有很大的特异性意义。

羊水细胞培养染色体检查检查过程

羊水细胞培养染色体检查的测定原理：羊水细胞是胎儿皮肤、消化道、呼吸道和经生殖泌尿系统脱落的细胞，95%左右是死细胞，因此必须经过细胞培养，使活的细胞得到充分的增殖，才能收获细胞，进行核型分析。

试剂：①F10培养液（如用RPMI1640，M199需加1mmol/L谷氨酰胺）pH6.5～6.8。②小牛血清。③Hanks平衡盐溶液（10倍浓缩）：甲液：NaCl80g，KCl4g，MgSO4·7H2O1g，MgCl2·6H2O1g，CaCl2·6H2O1.4g。将CaCl2溶于50ml三蒸水中，其它依次溶于400ml三蒸水中，两液混合，加三蒸水至500ml，加氯仿1ml混匀，保存于4℃冰箱中。乙液：Na2HPO4·12H2O1.52g，KH2PO40.6g，葡萄糖10.0g，4g/L酚磺酞液50.0ml。依次溶于三蒸水400ml中，加三蒸水至500ml，加入氯仿1ml混匀，保存于4℃冰箱。Hanks平衡工作液：甲液1份，乙液1份，双蒸水18份，混合后高压灭菌，置4℃冰箱保存。使用前以50g/LNaHCO3溶液调至适当pH。④4g/L酚磺酞液：酚磺酞0.4g置研钵中研碎，逐滴加入0.05mol/LNaOH22ml。

直到所有颗粒几乎完全溶解，加入三蒸水至100ml，置棕色瓶中保存。⑤2.5g/L胰蛋白酶溶液：称取胰蛋白酶250mg，溶于100mlHanks溶液中，过滤除菌，或用无钙、镁离子溶液配制。⑥无钙、镁离子溶液：NaCl8.0g，KCl0.2g，枸橼酸钠1.0g，NaH2PO4·H2O0.05g，NaHCO31.0g，葡萄糖1.0g。依次溶于三蒸水中，最后加三蒸水至1000ml，过滤除菌，贮存于4℃冰箱中备用。⑦EDTA胰蛋白酶溶液：贮存液：NaCl80g，KCl4g，葡萄糖10g，NaHCO35.8g，胰蛋白酶5.0g，EDTA2.0g。依次溶于900ml三蒸水中，并加4g/L酚磺酞5ml，加三蒸水至1000ml，抽滤除菌、分装，冻存备用。工作液：取贮存液1ml，加无菌三蒸水9ml即可。⑧双抗溶液。⑨秋水仙素（10μg/ml）。

操作方法：

（1）取孕期16～20周羊水15～30ml，1000r/ml离心10min。

（2）弃去多余上清液，留1ml羊水和沉淀细胞，轻轻打散成细胞悬液。

（3）移入25ml方形培养瓶中，加pH6.5～6.8（含青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml）的培养基3ml及小牛血清1ml，置37℃温箱中培养。

（4）培养7～10天后可见大量成纤维样或上皮样细胞集落。此时可调换新鲜培养液。

（5）待细胞集落扩大成片，并有许多透亮的圆形分裂细胞时，即可加入秋水仙素，使最终浓度为0.1～0.3μg/ml，置37℃温箱中再培养5～6h（上述过程均在无菌条件下进行）。收获标准：①以成纤维细胞为主要类型，成片细胞生长；②以10倍目镜和20倍物镜观察，生长的细胞克隆覆盖1个或1个以上完整视野；③见到10个以上透亮的圆形细胞和10个以上双圆形光亮的分裂细胞。

（6）如果细胞生长不旺盛，生长周期不齐或细胞老化，未达收获标准，可在原瓶继续传代培养。方法：在无菌条件下先倒去培养液，加入2.5g/L无菌胰蛋白酶液数滴，摇动后倒去。再加入胰蛋白酶5～10滴，在37℃下轻轻摇动约5min，使贴壁细胞脱落。加入含小牛血清的新鲜培养基4ml，在37℃静置培养4～5h。再小心更换培养液，继续培养，一般传代后3～5天即可收获。

（7）将培养液移至刻度离心管中，加ED-TA-胰蛋白酶液1ml于培养瓶内，置37℃温箱中5min，然后用弯头吸管冲洗贴壁细胞（也可用2.5g/L胰蛋白酶溶液消化）。将脱离瓶壁的细胞倒入离心管中，与原培养液相混合，并用少量温热生理盐水冲洗培养瓶，洗下的细胞也一并倒入该离心管，以1000r/min离心10min。

（8）吸弃上清液，加入预温37℃的0.075mol/LKCl低渗液3～5ml，置37℃10～15min。

（9）预固定、固定及制片均与外周血细胞染色体标本的制备法相同。